D-熒光素 活體成像之熒光素

D-熒光素

原理

D-熒光素(D-Luciferin)是熒光素酶(Luciferase)的常用底物,普遍應用于整個生物技術領域,尤其是體內活體成像技術。其作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下,熒光素(底物)能夠被氧化發光。當熒光素過量時,產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性(見下圖)。

說明: C:\Users\qcbio\Desktop\生化發光反應式.tif

將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的質粒轉染入細胞后,導入研究動物如大、小鼠體內,之后注入熒光素,通過生物發光成像技術(BLI)來檢測光強度變化,從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響,根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

分類

D-Luciferin, Sodium Salt D-Luciferin,Potassium Salt? D-Luciferin Firefly, Free Acid
分子式 NaC11H7N2O3S2 · H2O C11H7N2O3S2 K C11H8N2O3S2
分子量 320.32 g/mol 318.42 g/mol 280.33 g/mol
外觀 淡黃色粉末 淡黃色粉末 類白色至淺黃色粉末
溶解性 易溶于水(100 mg/ml) 易溶于水(60 mg/ml) 本品難溶于水,除非加入稀堿促進其溶解。
純度 99.7% 99.7% >99%

使用方法

1)體外實驗:

a:儲存液配置:將1 g的熒光素鈉鹽或鉀鹽溶解于33.3 ml水中,制備成30 mg/ml的儲存液。混勻,0.2μm濾膜過濾(可吹入惰性氣體,如氮氣,以防止氧化。)-80℃避光保存,一年內有效。

b:使用:①在冰上避光解凍(若是在冰上比較難解凍,可短暫溫浴,并輕柔混勻)。②用培養基以1:200的比例稀釋儲存液為150μg/ml。③去除培養細胞的培養基直至無殘留。④待圖像分析前,向細胞內添加1×熒光素工作液,然后進行圖像分析(或者細胞放在37℃短時間孵育約5min后檢測可增強信號)

2)活體成像:

a:工作液配置:①溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無Ca2+和Mg2+的DPBS中,配置成15 mg/ml的溶液。②混勻,0.2μm濾膜過濾(可吹入惰性氣體,如氮氣,以防止氧化。)-80℃避光保存,一年內有效。

b:使用:①在冰上避光解凍(若是在冰上比較難解凍,可短暫溫浴,并輕柔混勻)。

②按照動物體重150 mg/kg進行注射,(例如,20 g重的小鼠需要注射200μl )

③注射入體內10-20 min(待光信號達到zui強穩定平臺期),再進行成像分析。

注:建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線,從而確定zui高信號檢測時間和信號平臺期。

注射方法

1)腹腔注射:

將底物注射入腹腔中。推薦劑量為150 mg/Kg(例如,20 g重的小鼠需要注射200μl )。使用25 G的針頭,1 ml注射器。

其方法如下示意圖:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

進針5 mm,斜向上30°角。

2)靜脈注射:

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射,150 mg/Kg。注射液體的zui大體積不可超過血容量的10%。一般對于20 g 小鼠其血容量為2 ml,故其zui大注射量應為200μl。使用1 ml注射器26 G針頭,或者使用胰島素注射器28 G針頭,確保注射器中無氣泡。注射前將動物置于加熱燈下約5 min,或者將尾巴浸泡于溫水中以擴張血管。操作時將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中,乙醇消毒尾部,緩慢注射。

客戶實例

說明: 圖4

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻:Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對實驗有成影響嗎?

A有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲熒光素和螢火蟲熒光素之間有區別嗎?

A二者之間沒有區別。

Q3: 如何溶解熒光素,其溶液穩定嗎?

A熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml,熒光素鈉鹽溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的,但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml,在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

熒光素鈉鹽和鉀鹽的水溶液短期內存放于-80℃,對實驗效果沒有明顯影響。有實驗證明,將熒光素溶解于脫氧中的水中會更穩定些。

對于一些較為敏感的試驗,為了控制試驗中的可變因素,較推薦新鮮配置的反應液 。例如,低濃度的熒光素酶或者并非zui適的反應條件是需要高質量的底物才能進行反應? 。

Q4: 熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區別?

A目前的研究沒有發現二者在使用效果上的區別,僅在物理特征上有些小的差別,如熒光素鈉鹽溶解度會高于熒光素鉀鹽。但是在體內實驗研究中,有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽,據不完全統計,選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: 熒光素鈉鹽,熒光素鉀鹽,和熒光素游離酸之間有什么區別?

A游離酸不溶于水,在甲醇中的溶解度為10 mg/ml,在DMSO中溶解度為50 mg/ml,同樣可用?NaOH,KOH弱堿去調節溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過程中會更方便,尤其是在體內成像實驗中,因其能夠溶解在水中,反應毒性也會更小些。

Q6: 為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時候需用不含Ca2+Mg2+離子的PBS,有無別的鹽溶液可用來溶解熒光素?

APBS,或者其他的磷酸鹽緩沖液,或DPBS,常用來進行生物學研究或者細胞相關研究。PBS/DPBS為等滲溶液,PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無差別,只是通常情況下,DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg2+是催化熒光氧化的重要因素,Ca2+是和腔腸素氧化有關的離子。其他的鹽溶液也可用來溶解熒光素,但要避免溶液中的陽離對實驗造成影響。

Q7: 熒光素酶的發光特性?

A熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后,能夠表達熒光素酶的細胞開始發光,10 min后強度達到穩定的zui高點,在zui高點持續約20-30 min后開始衰減,約3 h后熒光素排除,發光全部消失,zui好的檢測時間是在注射后15-35 min內。其動力學曲線如下圖:

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內,注射方法之間的區別是什么?

A熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內。約1 min可擴散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對于腹腔注射來講,擴散較慢,開始發光較慢,持續發光時間較長。對于熒光素的尾部靜脈注射,擴散快,開始發光快,但發光持續時間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過血腦屏障嗎?

A熒光素底物約280道爾頓,熒光素的水溶性和脂溶性都非常好,很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達穩定性如何?

A通過穩定篩選等過程,熒光素酶基因是能夠插到細胞染色體內的。當細胞進行分裂、轉移、分化時,熒光素酶也得到持續穩定的表達,熒光素酶的半衰期約為3 h,故只有活細胞才能持續表達熒光素酶。

產品信息

產品名稱 產品編碼 規格 價格(元)
D-Luciferin, Sodium Salt D 熒光素鈉鹽 40901ES01/02/03/08/10 0.1/0.5/1/5/10 g 1008/2556/3996/15876/31212
D-Luciferin, Potassium Salt D 熒光素鉀鹽 40902ES01/02/03/08 0.1/0.5/1/5 g 1000/2600/3996/14898
D-Luciferin Firefly, Free Acid D 螢火蟲熒光素,游離酸 40903ES01/02/03 0.1/0.5/1 708/2556/3588
Coelenterazine Native 天然腔腸素 40904ES02/03/08 0.5/1/5 mg 589/1049/3899
Coelenterazine 400 a腔腸素 400a 40905ES02/03 0.5/1 mg 789/1499
Coelenterazine h 腔腸素h 40906ES02/03/08 0.5/1/5 mg 1329/2359/6759
Ready To Use Coelenterazine h 即用型腔腸素h 40907ES10 10 vials 6856
Coelenterazine f 腔腸素f 40908ES02/03 0.5/1 mg 1329/2359
Coelenterazine cp 腔腸素cp 40909ES72 250 μg 2359.00
Coelenterazine hcp 腔腸素hcp 40910ES72 250 μg 2359.00
Coelenterazine n 腔腸素n 40911ES72 250 μg 2359.00
Coelenterazine e 腔腸素e 40912ES02/03 0.5/1 mg 1329/2359
Coelenterazine 2-methyl 二甲基腔腸素 40913ES50 50 μg 929
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 11402ES60/80 100/1000次 536/4236元
Luciferase Reporter Gene Assay Kit

螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒

11401ES60/76/80 100/500/1000次 349/969/1748元