ProteoStat? 蛋白聚集檢測


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ENZ-51023-KP050 PROTEOSTAT??Protein?aggregation?assay
?ProteoStat????蛋白聚集檢測
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ENZ-51023-KP002 ProteoStat??Protein?aggregation?assay 2×96?tests

ProteoStat? 蛋白聚集檢測ProteoStat 蛋白聚集檢測

  某些肽鏈在經過錯誤折疊后很容易形成聚集,在生物技術和制藥領域,這些聚集會嚴重影響蛋白的生產和應用。許多以蛋白多肽為基礎研發的藥物具有極大的應用前景,可是蛋白因錯誤折疊而導致構象發生變化形成聚集,使蛋白失活,最終影響藥物療效,造成不可估計的損失。污染物導致的蛋白聚集包括宿主細胞蛋白、非蛋白微粒和蛋白的損傷形式。

  基于此Enzo Life Sciences 推出了新產品ProteoStat™ Protein Aggregation Assay,內含紅色熒光信號染料,可特異性結合聚集蛋白,進行檢測。具有最廣泛的檢測范圍,可有效檢測可見和不可見的蛋白微粒。


 ◆原理

  蛋白聚集嚴重影響以蛋白為基礎研發的藥物。在藥物制劑中,蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影響藥效。

  蛋白聚集發生在生產過程的各個階段包括細胞培養、純化、生產、儲存、運輸等方面。制藥工業希望在生物工藝中找到新的方法,可用于檢測、追蹤、定量分析影響蛋白聚集的因素。

  近年來以凍干穩定形式存在的蛋白聚集體作為標準品,可以準確地定量檢測蛋白聚集,加上新穎的只需在酶標儀里即可實驗的ProteoStat? protein aggregation assay,可對蛋白檢測方法進行優化。

  在這篇文章中,使用已知濃度的聚集IgG標準品作為標準曲線,通過ProteoStat? protein aggregation assay/standards對IgG的聚集水平進行檢測,集中分析了制藥工業中常見的3種聚集形式。

  ●    熱誘導聚集

  ●    機械誘導聚集

  ●    冷凍和反復凍融誘導聚集

ProteoStat? 蛋白聚集檢測

◆優點?特色


 ● 高通量篩選方法用于流式細胞儀平臺監測蛋白穩定性

 ● 在熒光微孔板中即可進行簡單、靈敏、均一地檢測

 ● 不需分離目的蛋白或稀釋樣品

 ● 與傳統蛋白聚集檢測染料相比更靈敏,信號更明亮

 ● 優化的緩沖液和輔料用于蛋白制劑研發

 ● 檢測靈敏度可低至亞微摩爾級別,含量在1%-5%的聚集蛋白也能被檢測出

 ● 在廣泛的PH(4-10)和離子強度范圍都可使用,提供至少兩個數量級的線性動態范圍

 ● 使用ProteoStat? 蛋白聚集檢測標準品可對溶液中的聚集蛋白精確定量

 ● 可檢測蛋白多肽聚集程度,可用于篩選蛋白聚集激活劑或抑制劑

在蛋白聚集實驗研究中,將ProteoStat protein aggregation assay和Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader聯用,可適合用于監測由溫度、機械損傷和反復凍融所引起的蛋白聚集。

穩定的蛋白顆粒作為標準品可快速建立標準曲線,加快定量分析蛋白聚集響應。這個檢測方法能夠可靠地檢測到濃縮抗體制劑中小于0.2%的聚集蛋白,線性動態范圍為2個數量級。

ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards檢測蛋白聚集特點在于操作簡單,能夠檢測低水平的蛋白聚集情況,只需30分鐘,就能夠得到完整的分析結果。


案例一

ProteoStat? 蛋白聚集檢測

不同攪拌速率對蛋白聚集的影響

案例二

ProteoStat? 蛋白聚集檢測

蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集

使用本產品檢測后,可知攪拌速度越快,蛋白聚集程度越大。

藍色曲線為對照,沒有攪拌速度在300rpm下,綠色曲線與紅色曲線分別表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情況與天然蛋白的聚集情況。使用本產品檢測后,可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

使用流式細胞儀結合ProteoStat蛋白聚集分析試劑盒使用例
ProteoStat? 蛋白聚集檢測 ProteoStat? 蛋白聚集檢測 ProteoStat? 蛋白聚集檢測

A ProteoStat蛋白聚集分析試劑盒檢測IgG 聚集標準品 B ProteoStat蛋白聚集分析試劑盒檢測硅油滴 C ProteoStat蛋白聚集分析試劑盒檢測IgG 聚集標準品和硅油滴的混合物

使用流式細胞儀結合ProteoStat蛋白聚集分析試劑盒檢測IgG 聚集標準品,可與其他非蛋白微粒如油滴區別開來,且無須考慮樣品微粒大小(經檢測>97%的IgG 聚集標準品都小于2μm)。

案例?應用

材料和方法

  Enzo Life Sciences 推出了ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards,利用熒光分子信號染料可特異性結合聚集蛋白和多肽,在微孔板中即可檢測。

探針在溶液中是不發出熒光的,當與聚集蛋白的四級結構結合時會發出明亮的熒光。一旦聚集標準品發生重組,它們將含有0-12.5%的聚集蛋白,總蛋白濃度維持在1mg/mL。

通過粒子分析成像鑒定標準品發現90%的蛋白聚集體長度為2-10μm,約9%的蛋白聚集體長度為10-20μm,約0.7%的蛋白聚集體為長度大于20μm。

Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments) 可用于所有蛋白聚集分析。它的激發波長為500nm,發射波長為600nm,激發和發射狹縫寬度為9nm,便于檢測ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激發單色器激發波長為435nm,發射波長為495nm,都在激發和發射狹縫寬度為9nm的條件下進行檢測。

 

結果

96孔微板中檢測比較ProteoStat和Thioflavin T染料與蛋白聚集的結合能力。純化的兔抗羊lgG(4.26mg/mL)在pH2.7的鹽酸水溶液中,80℃溫度下孵育90分鐘后會形成蛋白聚集體。

聚集信號由聚合體和單體混合比例不同決定的,但總的lgG蛋白濃度仍然是60μg/mL。在50 mM磷酸鉀,pH7,3μM ProteoStat 檢測試劑或5μM Thioflavin T 染料中讀數。這些濃度在以前做過預實驗,已經確定是最優的濃度。

在蛋白和染料一起孵育15分鐘后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader讀數。所用的板為Greiner μClear? black, clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。

在相同情況下,ProtesStat染料的熒光強度比Thioflavin T染料高100倍。對于濃度為1.2μg/mL的聚集體,ProteoStat染料的信噪比為12.8,而Thioflavin T染料的信噪比僅為1.2,表明ProteoStat染料在蛋白聚集檢測中更準確、靈敏度更高。

正因為由此顯著的優勢,ProteoStat protein aggregation assay和ProteoStat protein aggregation standards通常能夠共同用于各種常規形式的蛋白聚集檢測。

 

監控熱誘導聚集

當蛋白受到提高溫度刺激會加速其聚集。羊lgG(4mg/mL)在各個時期都處于攪拌速度400rmp,100mM磷酸鈉,pH7.2,溫度60℃下。

在每個時間點,25μL lgG用于測量。首先樣本在1x assay buffer中稀釋4倍后,得到的蛋白最終濃度為1mg/mL。在每個孔中加入98uL的檢測蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution,每個時間點都做平行孔。

同時,ProteoStat protein aggregation standards中含有穩定的、高質量的對照樣本,用來做標準曲線。

如圖1所示,使用ProteoStat染料檢測羊lgG在熱誘導下的聚集情況,生成的曲線表明不同階段lgG蛋白聚集的情況。

在剛開始階段蛋白聚集情況較少,接著觀察到生長階段聚集體開始形成,最后生長率降低直至變成0,表明蛋白單體已幾乎消失,差不多完全形成聚集體。

ProteoStat? 蛋白聚集檢測

1:熱誘導羊IgG蛋白聚集

 

監控機械誘導聚集

雖然普遍認為機械攪拌會加速蛋白聚集形成,但目前機械外力造成蛋白聚集形成的原理還不是十分明確。在藥物研發中,可能受到抽真空或者過濾等產生的機械外力使蛋白藥物形成聚集。

羊抗鼠lgG(10mg/mL)溶解在含有10mM的磷酸鈉,150mM Nacl,0.05% 疊氮化鈉,pH7.2的溶液中。機械攪拌的實驗條件如下:室溫、4mL的平底褐色玻璃瓶中加入200μL lgG溶液,使用Variomag? Poly electronic stirrer (2Mag-USA),以990rpm速度進行攪拌。攪拌棒體積為1.0×0.4×0.2cm3

在每個時間點,取10μL lgG用于檢測。樣品在1×assay buffer中稀釋10倍后,得到的蛋白最終濃度為1mg/mL。在每個孔中加入98uL的檢測蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution,每個時間點都做平行孔。

ProteoStat protein aggregation standards作為標準曲線,定量檢測機械攪拌誘導產生的蛋白聚集。在上述實驗條件下,蛋白聚集與時間成正比例關系(圖2)。

ProteoStat? 蛋白聚集檢測

2:機械誘導樣抗鼠IgG蛋白聚集

 

監控冷凍和反復凍融誘導聚集

冷凍對于蛋白穩定是至關重要的,因為在冷凍過程中會導致溶液的濃度發生變化。羊抗鼠lgG(10mg/mL) 溶解在10mM的磷酸鈉,150mM Nacl,0.05% 疊氮化鈉,pH7.2的溶液中。樣品保存在-20℃,反復凍融數次。

在每個時間點,取10μL lgG用于檢測。樣品在1×assay buffer中稀釋10倍后,得到的蛋白最終濃度為1mg/mL。在每個孔中加入98μL的檢測蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution,每個時間點做平行孔。

ProteoStat protein aggregation standards作標準曲線,定量檢測反復凍融誘導產生的蛋白聚集體。實驗表明反復凍融也會誘導產生蛋白聚集。與熱誘導引起蛋白聚集一樣,會觀察到一條S型曲線圖。

ProteoStat? 蛋白聚集檢測